熒光素酶基因原理報告

時間：2024-08-31 07:40:28

熒光素酶基因原理報告

熒光素酶基因原理報告

熒光素酶基因原理報告

　　Luciferase報告基因系統(tǒng)是以熒光素(luciferin)為底物來檢測螢

　　火蟲熒光素酶(fireflyluciferase)活性的一種報告系統(tǒng)。熒光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的過程中，會發(fā)出生物熒光(bioluminescence)。然后可以通過熒光測定儀也稱化學(xué)發(fā)光儀(luminometer)或液閃測定儀測定luciferin氧化過程中釋放的生物熒光。熒光素和熒光素酶這一生物發(fā)光體系，可以極其靈敏、高效地檢測基因的表達(dá)。是檢測轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動子區(qū)DNA相互作用的一種檢測方法。

　　雙熒光素酶報告基因測試∶ 結(jié)合螢火蟲和海洋腔腸熒光素酶先進(jìn)的共報告基測試技術(shù)在用螢火蟲熒光素酶定量基因表達(dá)時, 通常采用第二個報告基因來減少實(shí)驗(yàn)的變化因素。但傳統(tǒng)的共報告基因(比如CAT,β-Gal, GUS)不夠便利,因?yàn)楦髯缘臏y試化學(xué),處理要求檢測特點(diǎn)存在差異。

　　Promega提供一種先進(jìn)的雙報告基因技術(shù),結(jié)合了螢火蟲熒光素酶測試和海洋腔腸熒光素酶測試。雙熒光素酶報告基因測試系統(tǒng),結(jié)合pRL 載體系統(tǒng),表達(dá)第二個報告基因海洋腔腸熒光素酶,在單管中進(jìn)行雙熒光素酶報告基因測試,快速,靈敏,簡便。系統(tǒng)還提供 PLB裂解液,用來裂解在多孔板中培養(yǎng)的哺乳細(xì)胞,不需操作單個樣品。對于正在使用螢火蟲熒光素酶報告基因載體的研究人員。雙熒光素酶報告基因測試系統(tǒng)將使他們體會到該系統(tǒng)的便利。

　　應(yīng)用原理

　　轉(zhuǎn)錄因子是一種具有特殊結(jié)構(gòu)、行使調(diào)控基因表達(dá)功能的蛋白質(zhì)分子，也稱為反式作用因子。某些轉(zhuǎn)錄因子僅與其靶啟動子中的特異順序結(jié)合，這些特異性的序列被稱為順式作用元件，轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域和順式作用元件實(shí)現(xiàn)共價結(jié)合，從而對基因的表達(dá)起抑制或增強(qiáng)的作用。熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)（luciferaseAssay）是檢測這類轉(zhuǎn)錄因子和其靶啟動子中的特異順序結(jié)合的重要手段。

　　其原理簡述如下：

　　（1）構(gòu)建一個將靶啟動子的特定片段插入到熒光素酶表達(dá)序列前方的報告基因質(zhì)粒，如pGL3-basic等。

　　（2）將要檢測的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒與報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞或其它相關(guān)的細(xì)胞系。如果此轉(zhuǎn)錄因子能夠激活靶啟動子，則熒光素酶基因就會表達(dá)，熒光素酶的表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄因子的作用強(qiáng)度成正比。

　　（3）加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應(yīng)，產(chǎn)生熒光素，通過檢測熒光的強(qiáng)度可以測定熒光素酶的活性，從而判斷轉(zhuǎn)錄因子是否能與此靶啟動子片段有作用。

　　工作流程

　　（1）用生物信息學(xué)方法分析并預(yù)測啟動子區(qū)可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。

　　（2）設(shè)計引物用PCR法從基因組DNA中克隆所需的靶啟動子片段，將此片段插入到熒光素酶報告基因質(zhì)粒（pGL3-basic）中。

　　（3）篩選陽性克隆，測序。擴(kuò)增克隆并提純質(zhì)粒備用。

　　（4）擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄因子質(zhì)粒，提純備用。同時準(zhǔn)備相應(yīng)的空載質(zhì)粒對照，提純備用。

　　（5）培養(yǎng)293（或其它目的細(xì)胞），并接種于24孔板中，生長10-24小時（80%匯合度）。

　　（6）將報告基因質(zhì)粒與轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

　　（7）提取蛋白并用于熒光素酶檢測。

　　（8）加入底物，測定熒光素酶的活性。

　　（9）計算相對熒光強(qiáng)度，并與空載對照比較。

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