斑馬魚早期胚胎背腹發(fā)育中ripply1的作用論文
胚軸（ embryonic axes） 形成是多細胞生物軀體模式（ body plan） 建立的一個重要過程，主要包括前- 后軸 （ anterior-posterior axis ） 、背 - 腹軸 （ dorsal-ventral axis） 和左 - 右軸（ left-right axis） .對兩棲動物胚胎的研究發(fā)現(xiàn)背 - 腹軸早在受精后即可觀察到，如爪蛙胚胎皮層轉動形成的灰色新月區(qū)在后期發(fā)育成背部。德國發(fā)育生物學家 Hans Spemann 和他的學生 Hilde Mangold 將原腸早期蠑螈胚胎的背部組織移植到另一種蠑螈胚胎的腹部，得到了形成雙體軸的胚胎，次級體軸的脊索來自于供體胚胎，而神經管和體節(jié)多數(shù)來自于受體，這說明該背部組織能誘導周圍受體胚胎的細胞形成神經管，首次提出了胚胎誘導的概念并稱該背部組織為組織者（ or-ganizer） .
ripply 家族蛋白在 2005 年被發(fā)現(xiàn)并揭示了其部分功能[1],研究發(fā)現(xiàn) ripply1 和 ripply2 特異表達于體節(jié)，其中 Ripply1 蛋白與轉錄輔抑制因子 Groucho 結合，能夠終止分節(jié)基因的表達，維持體節(jié)的前后極性。之后對 ripply1 的研究都集中在其在體節(jié)時期對體節(jié)發(fā)生的作用，而其在早期胚胎模式發(fā)生的作用卻研究甚少。但最近在爪蛙中的研究發(fā)現(xiàn) ripply家族蛋白能通過其 WRPW 區(qū)域結合多梳蛋白（ Polycomb group proteins） 起轉錄去抑制的作用，并且在背 - 腹軸形成過程中起重要作用[2].然而，rip-ply 家族基因在胚胎發(fā)育早期的.表達圖式和調節(jié)方式還不清楚。并且，ripply3 是人的唐氏綜合征關鍵區(qū)域基因 6（ Down syndrome critical region gene 6,dscr6） 的同源基因[3].因此，研究 ripply 家族基因的功能和作用機制能為人類遺傳疾病的致病機理提供信息。我們通過原位雜交技術發(fā)現(xiàn) ripply1 在斑馬魚早期胚胎中特異表達在背部，因此推測其可能參與背腹發(fā)生。故而通過過 表 達 ripply1,并 調 取1. 2 kb的啟動子片段，初步研究其在胚胎早期背腹發(fā)生的作用。
1 材料和方法
1. 1 材料
AB 品系的斑馬魚養(yǎng)殖在 28. 5℃ 的循環(huán)水系統(tǒng)中，如早期工作所描述[4].
1. 2 方法
1. 2. 1 獲取 ripply1 cDNA取斑馬魚胚盾（ shield） 時期的胚胎 50 枚，用 Tr-izol 方法提取胚胎總 RNA,使用 Transgene 公司TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒反轉錄，詳細步驟參見使用說明書。
1. 2. 2 斑馬魚 ripply1 整胚原位雜交調取 ripply1 全長 cDNA,引物序列如下 ripply1-F: 5 '-CAGCGCCAAACAAAACG-3 ',ripply1-R: 5 '-TCAAATTCGCACAGACGG-3',使用 Taq 酶擴增后將其連入 pGEM-T 載體中。根據測序方向合成地高辛標記的反義 RNA 作為探針使用。其他探針如goosecoid （ gsc） 、chordin （ chd） 、floating head （ flh） 、even-skipped-like 1 （ eve1） 、T-box6 （ tbx6） 、wnt8a 詳見作者以前的工作[5].合成的 ripply1 反義 RNA 用原位雜交液 hyb+（ 50%甲酰胺，5 × SSC,0. 1% Tween-20,0. 5 mg/mL酵母 RNA,0. 05 mg/mL 肝素） 稀釋至 1 ng/μL.收集不同時期的斑馬魚胚胎，固定于 4% 多聚甲醛中過夜。過渡到含 0. 1% Tween-20 的 PBST 中，并在PBST 中將胚胎膜剝去，用 PBST 洗過后在原位雜交液 hyb-（ 50% 甲酰胺，5 × SSC,0. 1% Tween-20） 中65℃ 孵育 10 min,之后在 hyb+中 65℃孵育 4 h.探針 60℃ 孵育過夜。第 2 天吸出探針以重復使用。
胚胎用洗液 I（ 50% 甲酰胺，2 × SSC,0. 1% Tween-20） 洗 30 min（ 60℃ ） ,重復 1 次； 用洗液 II （ 5% 甲酰胺，0. 2 × SSC,0. 1%Tween-20） 洗15 min（ 60℃） ,重復 1 次； 用洗液 III （ 0. 5% 甲酰胺，0. 02 × SSC,0. 1% Tween-20） 洗 30 min（ 60℃ ） ,重復 1 次。然后用 MABT 在室溫下洗3 次，用封閉液封閉4 h.偶聯(lián)堿性磷酸酶的地高辛抗體 1∶ 2500 稀釋于封閉液中，4℃ 孵育過夜。第 3 天吸出抗體以重復使用，用MABT 在室溫下洗 30 min,重復 1 次； 用 PBST 在室溫下洗 30 min,重復 1 次； 在平衡緩沖液（ 0. 1 mol/LNaCl,0. 1 mol / L Tris-HCl pH 9. 5,0. 05 mol / L MgCl2,0. 1% Tween-20） 中平衡 10 min,加顯色液（ 5 mL 平衡緩沖液中加100 μL 60 mg/mL 左旋咪唑，100 μLNBT / BCIP） ,室溫避光，待信號足夠強加多聚甲醛終止反應，在70%酒精中脫去浮色，拍照觀察。
1. 2. 3 顯微注射 ripply1 mRNA顯微注射方法詳見早期工作[5].ripply1 mRNA注射劑量為每個胚胎 200 pg.
1. 2. 4 ripply1 啟動子序列及轉基因魚的獲得從基因組中調取 ripply1 基因組上游約 1. 2 kb的片段，引物如下： promoter-F: 5'-ATTCTCGAGG-GATCCAAAACAGCTTAT-3',promoter-R: 5 '-ATTA-GATCTGAATGAATGAAGGCGCGT-3'.并且在上下游引物中分別引入 Xho I 和 Bgl II 酶切位點，雙酶后切連入 pT2A200R150G 載體。
單獨注射該質粒觀察胚胎是否有熒光。有熒光后將該質粒和轉座酶 mRNA 共注射，劑量均為 50pg,待該批注射的斑馬魚 F0 代性成熟后外交，篩選后代胚胎有特異熒光的 F1 代。
2 結果
2. 1 整胚原位雜交揭示 ripply1 在斑馬魚早期胚胎發(fā)育過程中的表達模式為了明確 ripply1 是否參與早期背 - 腹軸的形成，我們首先利用整胚原位雜交檢測該基因的時空表達圖式。結果顯示 ripply1 母源表達，但表達水平低。在原腸作用早期即胚環(huán)期表達增強且集中在預定背部的胚盾位置，在胚盾期 ripply1 在背部的表達繼續(xù)增強，并且向側部延伸。在原腸期，隨著細胞運動的進行，ripply1 主要表達在前脊索板中胚層和后部將要形成的體節(jié)中，但在脊索中胚層中沒有表達（ 圖 1） .這個表達圖式暗示 ripply1 基因可能在背- 腹軸和前 - 后軸形成過程中起調節(jié)作用。
2. 2 高表達 ripply1 導致胚胎背部化
我們下一步對 ripply1 在背 - 腹軸形成中的作用進行了功能檢測。在胚胎 1 細胞期通過注射 rip-ply1 mRNA 進行高表達，收集胚盾時期的胚胎進行原位雜交。分別檢測背部標記基因 gsc、chd、flh 和腹部標記基因 eve1、tbx6、wnt8a 的表達。我們發(fā)現(xiàn)幾乎所有 ripply1 注射的胚胎背部標記基因 gsc、chd、flh 表達不但在背部增強并且明顯向腹側擴增。
相反，腹部標記基因 eve1、tbx6、wnt8a 表達明顯減弱（ 圖 2） .這個結果說明高表達 Ripply1 改變了背腹細胞的命運，使背部區(qū)域擴大。顯示 ripply1 能調節(jié)斑馬魚背部的發(fā)育。在 10 hpf（ 胚芽期） 時觀察胚胎的表型，發(fā)現(xiàn)原本呈球形的胚胎前后伸長，呈現(xiàn)明顯的橢球形，這是典型的背部化表型（ 圖 3A,B） .24 hpf 后觀察胚胎，大多數(shù)胚胎（ 82/99） 表現(xiàn)出背部化，其中 36 枚胚胎頭部增大，尾部缺失（ 圖 3C,D） ,而 46 枚胚胎頭部明顯增大，體軸變短，尾部變短，無腹部尾鰭（ 圖 3E） ,一小部分胚胎（ 6/99） 甚至呈現(xiàn)雙體軸（ 結果未顯示） .這些表型進一步說明 ripply1 通過抑制胚胎后部發(fā)育來促進前部的發(fā)育。
2. 3 ripply1 啟動子及轉基因斑馬魚
為了研究 ripply1 時空表達的調節(jié)機制，我們開展了對其啟動子的研究。獲得 ripply1 轉錄起始位點上游 1. 2kb 的片段后，將其后加 EGFP,然后克隆到 pT2A200R150G 轉基因載體上（ 圖4A,B） .質粒注射后發(fā)現(xiàn)在胚盾期在胚盾處有特異的熒光表達（ 圖 4C,D） ,體節(jié)期在體節(jié)處有特異的表達（ 結果未顯示） ,說明該 1. 2 kb 的片段能夠調控 ripply1 在斑馬魚胚胎中時空特異的表達。與轉座酶共注獲得轉基因魚 ripply1: EGFP 的 F0 代，發(fā)現(xiàn)其子代在 1細胞期即有熒光，直到胚盾期仍是泛表達（ 圖 5A-C‘） ,可能是由于 EGFP 比較穩(wěn)定，而母源的 ripply1比較容易降解。在體節(jié)期該熒光則特異定位在軀干（ 圖 5D,D’） .在 24 hpf,EGFP 信號主要集中在體節(jié)中（ 圖 5E） ,而在成魚中，EGFP 信號主要集中在整個軀干部分（ 圖 5F-G‘） .
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